书名：Ⅲ型效应因子NopM与共生结瘤
作者：辛大伟 [瑞士]ChristianStaehelin 陈庆山
ISBN：978-7-109-19117-4
出版社：中国农业出版社
出版日期：2014.07
豆科植物与根瘤菌建立的结瘤共生系统可以将大气中的氮气转化成铵盐，这对于农业生产具有重要意义。 根瘤菌的Ⅲ型泌出系统分泌出的Ⅲ型效应因子，在宿主专一性的选择上起着重要作用。 本书主要针对根瘤菌Rhizobiumsp.NGR234的Ⅲ型效应因子——NopM展开研究。 首先，对NopM的启动子区域分析发现，NopM的转录受根瘤菌TtsI元件调控，表明NopM是一个Ⅲ型效应因子。 通过对启动子区进行碱基突变，我们找到了影响启动子活性的关键碱基位点。 在大肠杆菌E.coli　BL21（DE3）中进行NopM的原核表达，通过6xHis标记分离纯化后，免疫新西兰大白兔，制备出全蛋白的兔产多克隆抗血清。 首次在体外试验中证明NopM具有E3泛素连接酶的功能。 为了深入研究NopM的生化功能，我们构建了NopM的相应突变体。 第338位氨基酸位点是NopM 行使E3泛素连接酶活性的关键位点。 亚细胞定位试验结果显示，NopM定位于洋葱的细胞核位置，提示NopM可能在宿主细胞的细胞核中起作用，从而泛素化宿主的某些蛋白，辅助共生关系的建立。 对所构建的突变体NGR△NopM和NGRNopMC338A进行结瘤试验，结果表明NopM在豆科植物超级扁豆（Lablab purpureus）中具有积极的调控作用。 在酵母的抑菌圈模型试验中，发现NopM可以抑制酵母的MAPK信号通路，且在这个信号通路中STE4的下游起作用，并且NopM的N端和C端结构域都对NopM的功能起不可或缺的作用。 为了进一步研究NopM在宿主植物中的作用，采用酵母双杂交技术以寻找扁豆中与NopM互作的功能蛋白。 但是NopM本身在正向的酵母双杂交中有自激活现象，所以构建了反向的酵母双杂交技术体系，并在此基础上构建了一个适合反向酵母双杂交的载体和扁豆cDNA文库。 经过筛选，找到两个可能与NopM存在互作的植物宿主蛋白，它们分别属于大豆的WRKY48家族和苜蓿的ARF GTPase activating protein家族。 关键词：根瘤菌NGR234，Ⅲ型泌出系统，MAPK信号通路，E3泛素连接酶，酵母双杂交。